Methodenausstattung

Bei der digitalen PCR handelt es sich um eine quantitative PCR Methode, mit der eine absolute Quantifizierung von  Veränderungen auf DNA oder RNA möglich ist. Die Methode ist ähnlich zur qPCR, jedoch werden die DNA/cDNA Moleküle vor der Amplifikation in viele tausend Reaktionskammern vereinzelt, mit dem Ziel, nur ein einziges Zielmolekül pro Reaktionskammer zu erhalten. Nach der Amplifikationsreaktion wird das Fluoreszenzsignal aller Reaktionskammern ausgelesen. Dabei wird gemessen und gezählt, ob und in wie vielen Kompartimenten die Zielsequenz amplifiziert wurde (digitales Prinzip). Die Anzahl der positiven Reaktionen ist direkt proportional zur Gesamtzahl der in der Probe vorhandenen Moleküle. Unter Anwendung der Poisson-Verteilung kann die Konzentration der Zielsequenz in der Originalprobe bestimmt werden. Mit dieser Methode ist eine Nachweisgrenze von 0,1% mutierten Allelen unter WT Allelen möglich.

Anwendung:

• Liquid Biopsie: Gezielter Nachweis von Mutationen und Fusionen.
• Mastozytose aus Kochenmarkstanzen.
• Sensitive Methode zum Nachweis von Mutationen in Tumorgewebeproben.

Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden direkt auf das Chromosomenpräparat hybridisiert. Es gibt Sonden für die Zentromere jedes Chromosoms, Painting-Sonden, die spezifisch ein ganzes Chromosom anfärben, und lokusspezifische Sonden, die gezielt ausgewählte DNA-Abschnitte markieren. Einen wesentlichen Vorteil bringt die FISH-Analyse bei hämatologischen Proben und an Schnitten aus FFPE-Tumormaterial, da hier krankheitsrelevante Regionen schnell und zuverlässig an Interphase-Zellkernen nachgewiesen werden können. So können aus Tumorzellen oder im Verlauf einer Erkrankung, ggf. Translokationen, Rearrangements, Deletionen und Zugewinne durch den Einsatz von speziellen Split- bzw. Break Apart-Sonden sowie lokusspezifischen Sonden nachgewiesen werden. Die FISH Analyse zeigt eine höhere Sensitivität. Diese liegt bei etwa einer aberranten Zelle unter 1.000 unauffälligen Zellen.

Anwendung:

• Nachweis von Bruchereignissen, Amplifikationen und Genfusionen aus Tumorgewebeproben.

Mittels Mikrosatteliteninstabilitätsanalyse kann die Länge von PCR-Fragmenten mittels Kapillargelelektrophorese ermittelt werden. Dazu wird in der PCR-Reaktion ein Fluoreszenz-markierter Primer eingesetzt. Anschließend werden die PCR-Produkte mit einem ebenfalls Fluoreszenz-markierten internen Standard gemischt, anhand dessen die spätere Bestimmung der Fragmentlängen erfolgt. In der darauffolgenden Kapillargelelektrophorese werden die PCR-Produkte in einer mit einem Polymer gefüllten Kapillare der Größe nach aufgetrennt. Beim Passieren der Detektionseinheit wird die Fluoreszenz der PCR-Produkte und des Standards über einen Laser angeregt und die Fluoreszenzemission detektiert. Die Fragmentlängen der PCR-Produkte werden anhand des internen Standards mit einer speziellen Software ermittelt.

Mikrosatelliten (MS) sind nicht-codierende DNA-Regionen, die über das gesamte Genom verstreut anzutreffen sind und aus einer variablen Anzahl von Wiederholungen eines bestimmten Sequenzmotivs bestehen. Jedes Individuum trägt in jeder kernhaltigen Zelle zwei Kopien (Allele) dieser Mikrosatelliten, die je nach Herkunft vom Vater oder von der Mutter unterschiedliche Längen aufweisen können. Das Muster der Längen mehrerer Mikrosatelliten ist für jeden Menschen (ausgenommen eineiige Zwillinge) einzigartig und bildet den sogenannten genetischen Fingerabdruck.

Anwendung:

• Mikrosatteliteninstabilität von Tumorgewebeproben
• Gewebeidentifikation
• Klonalitätsanalyse

Mitte der 1990er Jahre wurde die Methylierungsspezifische PCR (MS-PCR) entwickelt. Das Verfahren beruht auf der Umwandlung unmethylierter Cytosinreste zu Uracil mittels Natriumbisulfit und dem Einsatz von Primerpaaren, die entweder die nicht-modifizierte maternale oder die modifizierte paternale DNA erkennen.

Anwendung:

• MGMT Hypermethylierung
• MLH1 Hypermethylierung

Die Einführung der Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien hat die Etablierung bedeutender, neuer diagnostischer Anwendungen in der täglichen Routine ermöglicht. Obwohl der Einsatz der NGS-Technologie in der klinischen Diagnostik mit Herausforderungen verbunden ist, ist die Umstellung aufgrund der sich bietenden Vorteile dennoch unumgänglich. Neben der extrem hohen Sequenzierkapazität ermöglicht NGS die klonale Sequenzierung einzelner Moleküle, eine höhere diagnostische Sensitivität durch parallele Sequenzierung von ganzen Genpanels, vereinfachte Handhabung sowie die parallele und dadurch kostengünstigere Bearbeitung der Proben. Neueste technische Fortschritte haben NGS zu einer verlässlichen Alternative für die klassische Sanger-Sequenzierung entwickelt.

Amplicon basierte Sequenzierung

Die Amplicon-Strategie für die Anreicherung dieser Genabschnitte vereint „Target generation“ und „Library Preparation“ in einem; die dazu notwendigen PCR-Primer sind kommerziell erhältlich. Die Anreicherung der Zeilregionen auf DNA und RNA Ebene erfolgt über eine Multiplex-PCR, in dieser werden bis zu 300 Zielregionen parallel in einem Ansatz amplifiziert. Weiterführende Schritte wie Pooling, Aufreinigung und Normalisierung sind erfolgen im Anschluss. Die Auswertung der Rohdaten erfolgt mit einer eigenen Analysepipeline, die einen kontinuierlichen Sequenzabgleich mit der wichtigsten Datenbank ermöglicht.

Illumina SBS

Die Illumina sequencing-by-synthesis (SBS)-Methode wurde 2006 unter der Solexa eingeführt. Bei dieser Methode wird die fragmentierte Template-DNA über spezifische Adaptoren kovalent an einen Glasobjektträger (FlowCell) gebunden, auf der die Sequenzierreaktion stattfindet. Von dem gebundenen Startmolekül ausgehend werden durch einen PCR-ähnlichen Schritt Cluster aus identischen Molekülen gebildet (Bridge-amplification). Die Sequenzierung erfolgt zyklusweise und nutzt reversible Terminatorchemie und fluoreszenzmarkierte Nukleotide. In jedem Sequenzierzyklus wird genau ein Nukleotid komplementär zu der Template-DNA eingebaut. Anschließend wird die Fluoreszenzgruppe abgespalten, das folgende Lichtsignal detektiert und die Terminatorgruppe entfernt, so dass ein weiteres Nukleotid im folgenden Zyklus eingebaut werden kann. Ein besonderes Merkmal der Illumina SBS-Methode ist die Möglichkeit, eine sogenannte paired-end-Sequenzierung durchzuführen. Hierbei werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente von jeder Seite mit einer vorher festgelegten Leseweite von 100-250 bp sequenziert. Je nach Größe der DNA-Fragmente können diese Reads überlappen oder durch einen nicht-sequenzierten DNA-Teil (Insert) getrennt sein. Die Paired-end-Sequenzierung bietet viele Vorteile bei der bioinformatischen Auswertung und kann die Genauigkeit der Analysen signifikant erhöhen.

Es gibt mehrere Sequenzierinstrumente, die diese Methode verwenden, der Genome Analyzer IIx (GAIIx), die Nachfolgemodelle der HiSeq-Serie und NextSeq-Serie sowie Sequenziergeräte im Benchtop-Format (MiSeq, MiniSeq, ISeq). Der Durchsatz variiert je Gerät und ist geeignet für die Sequenzierung von kleineren Gen-Panels bis hin zu Whole-Exome und Whole-Genome Ansätzen.

Anwendung:

• Nachweis von somatischen Mutationen (SNV, INDELS, DEL), Spleißvarianten, Kopienzahlvariation (CNV) und Genfusionen auf RNA Ebene aus Tumorgewebeproben (z.B. NSCLC, Melanom, CRC und andere)
• Nachweis von somatischen Mutationen (SNV, INDELS, DEL), Spleißvarianten, und Genfusionen auf RNA Ebene aus Gesamtblut und Knochenmark bei hämatologischen Neoplasien (z.B. AML, MDS/MPN)

Für die PCR wird ein sequenzspezifisches, komplementäres Oligonukleotidpaar (Sense und Antisense Primer), thermostabile DNA-Polymerase und ein Mix der 4 Nukleotide Guanin (G), Adenin (A), Thymin (T) und Cytosin (C) benötigt. Die Primer haben eine Länge von 16-24 Basenpaaren und werden so ausgewählt, dass die Zielsequenz zwischen ihnen liegt. Die Auswahl der Primer ist ebenfalls ein kritischer Schritt, da neben der Amplifikation von unspezifischen Produkten vor allem die Amplifikation von Pseudogenen vermieden werden muss. Pseudogene sind inaktivierte Gene, deren Sequenz den zu untersuchenden Genen sehr ähnlich ist, wodurch falsche Ergebnisse entstehen können. Die PCR wird in einem speziellen Gerät durchgeführt (Thermocycler), welches in der Lage ist, die Temperatur des Reaktionsblocks sehr rasch zu ändern. Verschiedene Temperaturen sind notwendig, um die DNA zunächst zu denaturieren (Bildung von Einzelsträngen bei 95°C), dann die Anlagerung der Primer zu ermöglichen (sog. Annealing bei 50-65°C) und schließlich die Elongation der Primer entlang der DNA-Matrize zu einem neuen Tochterstrang zu gewährleisten (Temperatur-Optimum der DNA-Polymerase bei 72°C). Dieser Vorgang (Denaturierung, Annealing, Strangelongation) wird auch PCR-Zyklus genannt und 30–40 mal wiederholt. Bei jedem Zyklus verdoppelt sich idealerweise der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt, die Gesamtreaktion dauert etwa 1–2 Stunden.

Vorteile dieser einfachen und universell einsetzbaren Methode sind ihre Robustheit, Spezifität und Sensitivität. Auch geringste Spuren von DNA können mit dieser Methode nachgewiesen und diagnostischen Zwecken zugänglich gemacht werden. Dieser Vorteil bedingt allerdings auch den größten Nachteil: die Kontaminationsgefahr. Aus diesem Grund ist stets darauf zu achten, dass eine DNA-Probe möglichst nicht mit DNA-haltigem Material anderer Individuen in Berührung kommt. Zusätzlich werden in jedem Assay entsprechende Kontaminationskontrollen mitgeführt.

Anwendung:

• Nachweis von somatischen Mutationen (SNV, INDELS, DEL) aus Tumorgewebeproben (z.B. NSCLC, Melanom, CRC und andere)

Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Bei der Real-Time PCR kann über Fluoreszenzfarbstoffe die Zunahme von PCR-Produkten in Echtzeit verfolgt werden. Häufig wird sie für quantitative Analysen verwendet (qPCR). Des Weiteren wird sie zum Nachweis bekannter Varianten eingesetzt. Dabei erfolgt die Detektion über sequenzspezifische Sonden-Hybridisierung und Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET). Die Bestimmung des Genotyps erfolgt durch eine Schmelzkurvenanalyse (LightCycler®) oder Dot-Blot-Analyse (TaqMan®).

Für die Quantifizierung von Genabschnitten oder Transkripten findet die Real-Time-PCR Anwendung. Häufig verwendete Geräte sind LightCycler (Roche), LightCycler 480II (Roche), Taqman 7900HT (Life Technologies) und ViiA7 (Life Technologies). In diesen Geräten findet die Detektion von PCR-Produkten über Fluoreszenzsignale statt, entweder sequenzunspezifisch (z.B. über SYBR Green) oder sequenzspezifisch mittels fluoreszenzmarkierter Sonden. Die Anregung erfolgt über Laser, LED- oder Halogen-Lampen. Bei der sequenzspezifischen Detektion werden Sonden eingesetzt, die zu einem Abschnitt der zu analysierenden DNA bzw. cDNA komplementär sind. Die Zunahme des Fluoreszenzsignals im Verlauf der Reaktion ist proportional zur Menge des entstehenden PCR-Produkts und kann im Verlauf der Reaktion in Echtzeit verfolgt werden.

Durch die qPCR können z.B. chromosomale Fusionsgene bzw. deren Transkripte, die bei vielen Leukämie- und Lymphomformen entstehen, analysiert werden, was für das Monitoring der Erkrankung eine wichtige Rolle spielt.

Anwendung:

• Hochsensitiver Nachweis von somatischen Mutationen (SNV, INDELS, DEL) und Genfusionen aus Tumorgewebeproben

Die Suche und der Nachweis unbekannter Mutationen erfordern im Gegensatz zur zielgerichteten Diagnostik aufwändigere Verfahren, die von der Größe der zu untersuchenden Gene abhängen. Auch mit der Einführung neuer Sequenziertechnologien (Next Generation Sequencing (NGS)) wird die direkte DNA-Sequenzanalyse der einzelnen codierenden Abschnitte (Exons) eines definierten Gens sowie deren angrenzende Regionen nach Amplifikation durch PCR (Sanger-Sequenzierung) weiterhin in der Routinediagnostik eingesetzt. Etwa 35 Jahre nach der Entschlüsselung der Struktur der DNA wurden 1977 parallel zwei Technologien entwickelt, durch die die Abfolge der DNA-Bausteine aufgeklärt werden konnte: Frederick Sanger entwickelte eine Methode, durch die neue DNA enzymatisch erzeugt wird, welche anschließend analysiert werden kann (Kettenabbruch-Synthese). Die Sequenzierung nach Maxam und Gilbert dagegen erfolgt mittels eines chemischen Abbaus der DNA. Bei der Didesoxy-Methode der Sequenzierung (Kettenabbruch-Synthese) werden neben der DNA-Polymerase und dem Nukleotid-Mix zusätzlich fluoreszenzmarkierte Stoppnukleotide (Dideoxy-Nukleotide) eingesetzt, bei deren Einbau es zu einem Abbruch der Reaktion an dieser Stelle kommt. Hierdurch entstehen fluoreszenzmarkierte Kettenabbruchprodukte unterschiedlicher Länge, die sich in einem Polyacrylamid-Gel der Größe nach auftrennen und mittels Laserlichtanregung darstellen lassen. Für dieses Verfahren wurde Frederick Sanger 1980 mit seinem 2. Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

Durch die richtige Mischung von Nukleotid-Mix und Stoppnukleotiden wird erreicht, dass die Reaktion „zufällig“ zum Stehen kommt und letztlich alle theoretisch möglichen Sequenzfragmente dargestellt werden. Da die Stoppnukleotide mit 4 unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, kann man bei der Auswertung die einzelnen Basen unterscheiden und die  Abfolge  anhand der Größe der  Fragmente bestimmen. Das Auslesen der Rohdaten erfolgt mit Hilfe einer speziellen Software, die Feinauswertung (Editierung) durch einen erfahrenen Mitarbeiter am Computermonitor. Die DNA-Sequenzanalyse wird in der Routine zur Mutationssuche und zum Nachweis bekannter Mutationen bei monogenen Erkrankungen eingesetzt. In der Routinediagnostik kommen mehrkanalige (16/48/96) Kapillarelektrophoresegeräte zum Einsatz.

Zu den wichtigsten Vorteilen der direkten DNA-Sequzenzanalyse gegenüber Screening-Verfahren gehören die Vergleichbarkeit der Daten, die auf einer weitgehend standardisierten Methode beruhen, die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Methode, die Sicherstellung der Qualität durch internationale Ringversuche und die vergleichsweise einfache Durchführbarkeit ohne aufwändige Optimierungsschritte.

Anwendung:

• Nachweis von somatischen Mutationen (SNV, INDELS, DEL) und Genfusionen aus Tumorgewebeproben